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Probiotika bestehen aus zumeist einzelligen Mikroorganismen, die mit bloßem Auge nicht zu erkennen sind. Insgesamt leben mehr als eine Billiarde dieser Kleinstlebewesen auf dem menschlichen Körper. Dabei handelt es sich hauptsächlich um Bakterien, die zu einem Großteil auch im Magen-Darm-Trakt angesiedelt sind.
Die Herstellung von Probiotika konzentriert sich zurzeit auf die Milchsäurebakterien der Gattung Laktobazillus und Bifidobakterium. Diese Bakterien sind bereits von Natur aus Bestandteil der Darmflora und erfüllen mit ihren diversen Unterarten, wie etwa Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei oder Bifidobacterium bifidum, alle Anforderungen an ein probiotisches Bakterium. Sie sind eindeutig charakterisierbar, stabil und aufgrund ihrer Wirkung zur Produktion von Probiotika für den europäischen Markt zugelassen. An der Umwandlung der bisherigen Anforderungen an probiotische Bakterien zu weltweiten Standards nach festgelegten, gesetzlichen Richtlinien wird derzeit allerdings noch von der WHO in Zusammenarbeit mit der FAO gearbeitet.
Die für Probiotika notwendigen Laktobazillen und Bifidobakterien lassen sich bisher nicht künstlich herstellen. Sie müssen, ebenso wie andere Lebewesen, gezüchtet werden, was heutzutage unter strengen hygienischen Vorkehrungen in speziell dafür ausgelegten Laboren erfolgt. Zugeschnitten auf die einzelnen Bakterienstämme werden hier ideale Lebensbedingungen geschaffen, um ein rasantes Wachstum der Kolonien zu erreichen. Dabei ist es notwendig, eine permamente Verlaufskontrolle durchzuführen, um Abweichungen von der ursprünglichen Stammkultur, dem sogenannten Ausgangsstamm, zu vermeiden. Gegenwärtig laufen auch einige Versuche, die Bakterien vorab gentechnisch zu verändern, um deren Wirkung und deren Anwendungsbereich zu vergrößern. Zugelassen wurden diese Probiotika allerdings bisher noch nicht.
Größtenteils werden die gezüchteten Bakterienkulturen anschließend zur Weiterverarbeitung schockgefrostet. In dieser Form ist es bei fachgerechter Lagerung möglich, eine lange Lebensdauer für die Mikroorganismen zu erreichen. Deshalb ist es möglich, Probiotika auch als magensaftresistente Kapseln oder in Pulverform anzubieten. Im Gegensatz zu probiotischen Lebensmitteln haben diese Präparate zudem den Vorteil, dass bereits während der Herstellung ein ausgewähltes und besonders effektives Mischungsverhältnis von verschiedenen Bakterienstämmen erzeugt werden kann. Darüber hinaus ist die Anzahl der verwendeten Mikroorganismen im Probiotikum nahezu garantiert und aufgrund unterschiedlicher Präparatgrößen für den Verbraucher frei wählbar.
Der labortechnischen Züchtung probiotischer Bakterien steht die natürliche Erzeugung der Kulturen gegenüber. Eine Vielzahl an Nahrungsmitteln enthält bereits von Natur aus Milchsäurebakterien, die bei Vorherrschen bestimmter Bedingungen von selbst mit ihrem Wachstum beginnen. Typisches Beispiel hierfür ist das Sauerkraut, das durch Fermentierung und mithilfe der im Weißkohl enthaltenen Bakterien entsteht. Auch Joghurt, einst per Zufall entdeckt, entwickelt sich aufgrund der in der Milch vorhandenen Milchsäurebakterien im Prinzip von allein.
Diese natürlichen Vorgänge lassen sich jedoch nur schwer steuern und so sind Gattung und Menge der entstehenden Bakterien oftmals nicht vorhersehbar. Sie unterliegen meist großen Schwankungen und einer hohen Sterblichkeitsrate.
Alternativ ging die Forschung dazu über, bestimmten Lebensmitteln zusätzliche probiotische Bakterien zuzusetzen. Die zuvor im Labor gezüchteten Stämme werden vor allem bei der Produktion von Joghurt, Quark, Käse oder verschiedenen Wurstsorten eingesetzt. Selbst die Herstellung von probiotisch angereichertem Speiseeis hat sich hierbei bereits als machbar erwiesen. Dennoch ist auch mit diesen Produkten eine gezielte Dosierung des Probiotikums kaum möglich.